內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞來源的neuropilin樣分子(endothelialandsmoothmusclecell-derivedneuropilin-likemolecule,ESDN)是一類Ⅰ型跨膜蛋白,其分子內(nèi)含有一個(gè)CUB結(jié)構(gòu)域?一個(gè)LCCL結(jié)構(gòu)域和一個(gè)凝血因子Ⅴ/Ⅷ同源結(jié)構(gòu),與neuropilins結(jié)構(gòu)相似,而neuropilins可以調(diào)控多種生長因子受體的信號(hào)途徑,推測(cè)ESDN可能具有類似的功能?越來越多的研究表明,ESDN在調(diào)節(jié)血管細(xì)胞生長方面起著重要作用?Nie等研究發(fā)現(xiàn),ESDN能夠通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)信號(hào)途徑進(jìn)而誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖?遷移過程,從而促進(jìn)血管生成;在離體培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmoothmusclecell,VSMC)中,處于增殖狀態(tài)時(shí)ESDN表達(dá)顯著高于生長抑制的細(xì)胞,而ESDN的過度表達(dá)則抑制VSMC生長,其分子機(jī)制可能與ESDN對(duì)血小板衍生因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)及其受體調(diào)控有關(guān)?VEGF和PDGF作為一類強(qiáng)效促有絲分裂劑,是介導(dǎo)VSMC增殖和內(nèi)膜增生的關(guān)鍵因素?ESDN能夠調(diào)控這2種生長因子的信號(hào)途徑,表明ESDN的表達(dá)可能與血管增生密切相關(guān)?血管增生是動(dòng)脈粥樣硬化?高血壓?血管成形術(shù)后再狹窄等心血管疾病中普遍存在的病理生理表現(xiàn)?其主要特征表現(xiàn)為血管損傷后,位于血管中膜的呈收縮表型的VSMC出現(xiàn)表型轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣杀硇?增殖并遷移至內(nèi)膜從而導(dǎo)致的一種血管重構(gòu)現(xiàn)象?為進(jìn)一步研究ESDN表達(dá)與血管增生的關(guān)系,本研究利用本室保存的Esdn基因敲除小鼠及野生型小鼠構(gòu)建頸總動(dòng)脈結(jié)扎血管內(nèi)膜增生模型,比較結(jié)扎后不同時(shí)間Esdn基因敲除(Esdn-/-)小鼠與野生型小鼠血管內(nèi)膜增生情況,觀察Esdn-/-小鼠及野生型小鼠VSMC分化表型標(biāo)志蛋白平滑肌α-肌動(dòng)蛋白(smoothmuscleα-actin,SMα-actin)和SM22α,以及VSMC增殖表型標(biāo)志蛋白———骨橋蛋白(osteopontin,OPN)在血管組織中的表達(dá)差異變化?通過探究ESDN表達(dá)與血管重構(gòu)的關(guān)系,進(jìn)一步闡明ESDN的表達(dá)在VSMC生物學(xué)功能改變中的重要作用,這將有助于加深對(duì)血管炎性疾病的病理生理過程的理解,可為心血管疾病的防治和癌癥控制提供有力武器,并為 臨床診斷?治療血管炎性疾病提供新思路。

Esdn-/- 小 鼠 與 野 生 型 小 鼠,8~12 周 齡,來 自 Dr.MehranSadeghi(Yale University)饋 贈(zèng),保 存?繁 育 并 飼 養(yǎng) 于 SPF 級(jí) 動(dòng) 物 房,IVC系統(tǒng),清潔飲水,自由取食?環(huán)境采用12h 明暗循環(huán),早7:00至晚7:00照明,晚7:00至次日 早7:00無照明?所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照河北醫(yī)科大 學(xué)動(dòng)物管理?xiàng)l例進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)過程對(duì)動(dòng)物的處置符合 動(dòng)物倫理學(xué) 要 求?本 研 究 所 用 SM α-actin兔 多 克 隆抗體(ab5694)?SM22α抗 體 (ab14106)?OPN 兔 多克隆抗體(ab8448)購 自 Abcam 公 司(1∶1000稀 釋),β-Actin 兔 單 克 隆 抗 體 (4970)購 自 Cell signaling公司(1∶1000稀 釋),抗 兔 Alexa488免 疫 熒光二 抗 購 自Invitrogen公 司(A-11034,1∶200稀 釋)

FRESCO17低溫離心機(jī)(Thermo 公司),KA-1000低速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠), 激光共聚焦顯微鏡(Leica公司),電泳儀?半干式蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)膜槽和發(fā)光顯影儀(Bio-Rad公司)。

建立小鼠頸總動(dòng)脈結(jié)扎血管內(nèi)膜增生模型,術(shù)后將Esdn-/- 小鼠? 野生型分別隨機(jī)分為結(jié)扎術(shù)后3,7,14,21d組和假 手術(shù)組(只分離血管,不結(jié)扎),每組6只?術(shù)后相應(yīng) 時(shí)間處死小鼠,迅速分離結(jié)扎側(cè)頸總動(dòng)脈用于實(shí)驗(yàn)。

血管組織加入適量組織 裂解液 RIPAbuffer(150mmol/LNaCl,50mmol/ LTris-HCl,pH7.5,1% NP-40,0.5%脫氧膽酸鈉, 0.1% SDS,1mmol/LEDTA,臨用前加入complete proteinaseinhibitor(Roche Applied Sciences)和 phosphataseinhibitorcocktails (Sigma-Aldrich), 勻漿,離心分離上清,改良 Lowry法蛋白定量,取等量蛋白提取液進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS- polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE)? 電轉(zhuǎn) 移 至 PVDF 膜 上,應(yīng) 用 SM α-actin?SM22α和 OPN 孵育并與相應(yīng)的二抗反應(yīng),化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)抗 原抗體結(jié)合區(qū)條帶,用Image-J軟件進(jìn)行定量分析。

將冰凍切片置于預(yù)冷丙酮酸溶液中固定5min,TBS緩沖液洗滌3次,5min? 5%山羊血清封閉30min,隨后加入抗體4 ℃濕盒過 夜,TBS緩沖液洗滌后加入熒光二抗,避光,室溫30 min?TBS緩沖液洗滌后,DAPI染核,80%甘油封片?激光共聚焦顯微鏡觀察和攝照。

應(yīng)用 SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)?計(jì)量資料比較分別采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)?F檢驗(yàn)和SNK-q 檢驗(yàn)?P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

ESDN是使用改良信號(hào)序列捕獲技 術(shù),從原代培養(yǎng)的人冠狀動(dòng)脈細(xì)胞和高轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞中克隆 得到的一 種新型跨膜蛋 白?Northern印 跡 研 究 表 明,ESDN 在人與胎兒的骨骼肌?胎 盤?心 臟?結(jié) 腸? 卵巢和前列腺等組織廣泛表達(dá),尤其以成人睪丸表達(dá)量最高?另外,ESDN 在成年大鼠迷走神經(jīng),小鼠 心臟?肺部?主動(dòng)脈以及胚胎迷走神經(jīng)和腦組織也高 表達(dá)?本研究前期利用cDNA 芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn),正 常血管中Esdn?Vegfr-2及 Neuropilin-1均為低表 達(dá),但它們?cè)趧?dòng)脈粥樣硬化血管和發(fā)生血管重構(gòu)的 血 管 (remodelingartery)組 織 中 的 表 達(dá) 急 劇 升 高?另外,ESDN 能 夠 通 過 調(diào) 節(jié) PDGF?VEGF 和表皮生長因子(epidermalgrowthfactor,EGF)信 號(hào)途徑參與血管再生及腫瘤發(fā)生發(fā)展等病理生理過程。