蘆柑( Citrus reticulate Blanc Ponkan) 屬蕓香科柑 橘屬植物，其果實(shí)碩大，肉質(zhì)脆嫩，汁多化渣，但果實(shí)在 采后、運(yùn)輸貯藏及貨架期極易感染綠霉病和青霉病，導(dǎo) 致其感染的腐敗真菌菌種主要是意大利青霉 ( Penicillium italicum ) 和 指 狀 青 霉 ( Penicillium digitatum ) 。 此 外， 擴(kuò) 展 青 霉 ( Penicillium expansum) 也能導(dǎo)致青霉病發(fā)生，其侵染果實(shí)后分泌的 展青霉素是一種神經(jīng)性真菌毒素，不僅會(huì)對(duì)食用者造 成潛在的危害，而且還會(huì)嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。 目前，蘆柑市場(chǎng)所用的保鮮劑可以抑制綠霉和青霉病， 但是化學(xué)保鮮劑不僅會(huì)危害人體健康而且會(huì)污染環(huán) 境; 物理保鮮劑往往需投入一定的設(shè)備成本; 生物 保鮮技術(shù)受外界環(huán)境影響較大。其中，植物精油 作為一種極具潛力的天然殺菌劑，不僅能有效抑菌而且可以增強(qiáng)蘆柑果實(shí)保鮮效果，是化學(xué)保鮮劑的良 好替代品。勝紅薊( Ageratum conyzoides L．) 是一種 外來入侵植物，屬于區(qū)域性惡性雜草，其入侵農(nóng)田 后會(huì)造成農(nóng)作物減產(chǎn)，給生態(tài)環(huán)境和人體健康帶來危 害。研究表明，勝紅薊精油主要成分為氧萘烯類物質(zhì)， 如早熟素和石竹烯等，對(duì)多種真菌具有抑制作 用。寧蕾等研究發(fā)現(xiàn)勝紅薊精油對(duì)香蕉炭疽 病菌( Glorosprium musarum Cookeet Mass) 和柿角斑病 菌( Cercospora kaki Ell． et Ev．) 抑菌率高達(dá) 100%。

采摘福建永春果園中 福建蘆柑作為試驗(yàn)材料。挑選成熟度一致、無病蟲害、 無機(jī)械損傷、直徑為 65 ～ 75 mm 的果實(shí)。供試菌種為 意大利青霉( P． italicum) 、指狀青霉( P． digitatum) 和 擴(kuò)展青霉( P． expansum) ，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)和中國(guó)農(nóng)業(yè) 科學(xué)院柑橘研究所提供。 孢子懸浮液的制備: 用無菌水將培養(yǎng)在馬鈴薯葡 萄糖瓊脂( potato dextrose agar，PDA) 培養(yǎng)基斜面上的 意大利青霉、擴(kuò)展青霉和指狀青霉孢子分別洗下，用血 球計(jì)數(shù)板將孢子濃度用無菌水調(diào)整到 106 CFU·mL－1 ， 得孢子懸浮液。再將各孢子懸浮液取等量的體積混合 均勻，即得混合菌孢子懸浮液。 吐溫－80( 汕頭市西隴化工有限公司) 、碳酸鈉( 西 隴化工股份有限公司) 、無水乙醇( 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限 公司) 、次氯酸鈉( 西隴科學(xué)股份有限公司) 均為分析 純; 羧甲基殼聚糖購(gòu)自浙江澳興生物科技有限公司; 咪 鮮胺購(gòu)自黑龍江省佳木斯黑龍農(nóng)藥化工股份有限公 司; 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物有 限公司；生化培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

采用超聲波輔助水蒸氣蒸餾法提取勝紅薊精油，工藝條件: 超聲功率 120W、超聲時(shí)間 30 min、料液比 1 ∶20 和粉末粒度 40 目。按照不同質(zhì)量比( 1 ∶1、1 ∶2和 1 ∶3) 將勝紅薊精油與無水乙醇混合均勻作為油相，添加不 同濃度的碳酸鈉、羧甲基殼聚糖作為水相，油相與表面 活性劑吐溫－80 按不同的質(zhì)量比( 10 ∶0、9 ∶1、8 ∶2、7 ∶3、 6 ∶4、5 ∶5、4 ∶6、3 ∶7、2 ∶8、1 ∶9 和 0 ∶10) 混合均勻，向上述 混合溶液中逐漸加入水相，觀察體系的狀態(tài)變化。當(dāng) 體系由澄清變?yōu)闇啙幔蛴蓽啙嶙優(yōu)槌吻鍫顟B(tài)時(shí)，記錄 變化時(shí)的臨界加水相量，采用 Origin 9. 0 軟件繪制擬 三元相圖———多相區(qū)( 體系呈乳白色渾濁態(tài)) 、單相區(qū)( 即微乳液，呈均勻透明狀) 及液晶區(qū)( 呈半凝固均一 狀) 。在擬三元相圖中利用單相區(qū)面積( AT ) 來評(píng)價(jià)各 成分的增溶能力，用動(dòng)態(tài)激光粒度分析儀測(cè)定溶液粒 徑，篩選最佳微乳液體系配方。

本研究選用吐溫－80 作為表面活性劑，以乙醇為 助表面活性劑，以碳酸鈉和羧甲基殼聚糖為水相，利用 擬三元相圖確定最終的微乳液體系，結(jié)果見圖 1。加 入不同比例的乙醇考察其對(duì)微乳體系相行為的影響 ( 圖 1-A) 。當(dāng)勝紅薊精油與乙醇的質(zhì)量比為 1 ∶1，形 成的單相區(qū)面積 AT 為 66. 04%; 隨著勝紅薊精油與乙 醇的質(zhì)量比提高到 1 ∶3，微乳液體系單相區(qū)面積增加 至 85. 59%，故選擇勝紅薊精油與乙醇的質(zhì)量比為 1 ∶3 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。加入不同濃度的碳酸鈉考察其對(duì)微乳 體系相行為的影響( 圖 1-B) 。3%碳酸鈉溶液形成最 大的單相區(qū)面積 AT 為 93. 22%，而 5%碳酸鈉溶液形 成的單相區(qū)面積 AT 下降至 59. 35%，故選擇 3%碳酸 鈉進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。加入不同濃度的羧甲基殼聚糖考察 其對(duì)微乳體系相行為的影響( 圖 1-C) 。隨著羧甲基殼 聚糖溶液濃度增加，形成的微乳液?jiǎn)蜗鄥^(qū)面積 AT 逐 漸減小，由 84. 63%下降至 14. 99%，故確定 0. 5%羧甲 基殼聚糖進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。 不同比例的 3%碳酸鈉和 0. 5%羧甲基殼聚糖溶 液作為水相對(duì)微乳體系相行為的影響( 圖 1-D) 。3% 碳酸鈉和 0. 5%羧甲基殼聚糖比例為 1 ∶3時(shí)，能形成較 大的單相區(qū)，且當(dāng)油相與吐溫－80 的比例為 1 ∶1 時(shí)，存 在無限稀釋線，而 3%碳酸鈉和 0. 5%羧甲基殼聚糖比 例為 1 ∶1和 3 ∶ 1 時(shí)，形成的單相區(qū)面積減少，故選擇 3%碳酸鈉和 0. 5%羧甲基殼聚糖比例為 1 ∶3時(shí)的相圖 作為最終的復(fù)合微乳液體系。

在三相圖內(nèi)，空白區(qū)域?yàn)閱蜗鄥^(qū)，即為微乳液區(qū)。 在微乳液區(qū)域選取無限稀釋線，即稀釋線上對(duì)應(yīng)的點(diǎn) 表示的各組分在此比例下均能形成微乳液。針對(duì)篩選 出的復(fù)合微乳液相圖，選取最高的一條無限稀 釋線，即 L55。此時(shí)，精油 ∶乙醇 = 1 ∶3作為油相，油相 ∶ 吐溫－80 = 1 ∶1，3%碳酸鈉 ∶0. 5%的羧甲基殼聚糖= 1 ∶3 作為水相，測(cè)定這條稀釋通道上隨著水相的增加其納 米粒徑的變化情況。A60、A70、A80和 A90體 系微乳液粒徑分別為 59. 68、51. 28、34. 47、91. 81 nm， 均小于 100 nm，符合微乳液粒徑在 1 ～ 100 nm 之間的 定義。A80體系的多分散系數(shù)( polymer dispersity index， PDI) 值為 0. 530，說明勝紅薊精油、吐溫－80、乙醇、碳 酸鈉和羧甲基殼聚糖等成分形成的微乳液體系分散性 好。因此，選取 A80體系的微乳液進(jìn)行后續(xù)研究。

復(fù)合微乳液 A80能有效抑制意大利青霉、指狀青 霉和擴(kuò)展青霉的生長(zhǎng)，20 mg·mL－1 復(fù)合微乳液 A80與冷 藏( 4℃ ) 保鮮結(jié)合能有效降低貯藏期間蘆柑果實(shí)的失 重率和腐爛率，這與 Ｒaid 等利用橘皮精油微乳液 延長(zhǎng)鮮切橙的貨架期效果相似。其主要原因可能是勝 紅薊精油作為植物天然抑菌物質(zhì)，含有一些生物 活性成分，如揮發(fā)性的單萜、倍半萜和檸檬苦素、類黃 酮等，這些活性成分具有抑菌作用。且加入的乙 醇、3%碳酸鈉溶液及 0. 5%羧甲基殼聚糖，使得本研究 構(gòu)建的復(fù)合微乳液增溶能力增強(qiáng)，延長(zhǎng)了對(duì)蘆柑的保 鮮效果。同時(shí)，精油與乙醇的質(zhì)量比為 1 ∶3時(shí)，有較好的增溶效果，說明加入短鏈醇乙醇能明顯降低界面膜 的彎曲系數(shù)，一定范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的增加，微乳 液的增溶能力增強(qiáng)，這與 Chen 等的研究結(jié)論一致。 選取 3%碳酸鈉作為水相，是因?yàn)橐欢舛鹊柠}溶液 能提高表面活性劑的親水性能，但是過高濃度的鹽溶 液會(huì)導(dǎo)致非離子型表面活性劑( 吐溫－80) 產(chǎn)生鹽析作 用，鹽析作用聚集到一定程度后會(huì)造成微乳液體系產(chǎn) 生渾 濁，形 成 多 相 區(qū)，這也驗(yàn)證了前人的研究結(jié)論。選取 0. 5%羧甲基殼聚糖作為水相是由于高 濃度羧甲基殼聚糖分子間存在極強(qiáng)的氫鍵作用而相互 纏繞，使得能進(jìn)入界面膜的羧甲基殼聚糖分子減少，會(huì) 造成增溶能力減弱。